综上所述，TCR-T细胞治疗与AMP疫苗接种相结合可促进全面的淋巴免疫激活，从而增强TCR-T细胞活性并促进内源性抗肿瘤T细胞应答，从而改善实体瘤的根除并持久防止复发。
虽然TCR修饰的T细胞疗法在治疗实体瘤方面显示出了希望，但在临床实践中，总体治疗效果并不理想，部分原因是体内T细胞的持续和激活不佳，以及肿瘤抗原逃逸的可能性。在这里展示了一种通过结合包括同源TCR-T多肽的两亲性(Amphiphile，AMP)疫苗接种来增强TCR-T细胞在体内的持久性和激活的方法。AMP修饰改善了结合的肿瘤免疫原和佐剂的淋巴靶向性，从而协调了强大的T细胞启动的内源性免疫反应。疫苗与TCR-T细胞治疗相结合，可同时在体内激活过继转移的TCR-T细胞，并原位启动内源性抗肿瘤T细胞库。由此产生的过继和内源性抗肿瘤效应的诱导导致了对TCR-T细胞单一疗法无效的已建立小鼠实体瘤的持久反应。对复发的保护与抗原扩散到额外的肿瘤相关抗原有关，而不是疫苗接种的靶标。抗肿瘤疗效的增强与促炎淋巴结转录重编程和抗原提呈细胞成熟度增加有关，因此导致TCR-T细胞在淋巴结和实体瘤实质内的扩增和功能增强，而不会耗竭淋巴。AMP多肽与针对NY-ESO-1、突变KRAS和HPV16 E7匹配的人TCR-T细胞的体外评估表明，AMP疫苗具有增强人TCR-T细胞增殖、激活和抗肿瘤活性的临床潜力。总的来说，这些研究提供了支持AMP疫苗接种与TCR-T细胞疗法相结合以增强抗肿瘤活性的临床评估的理论基础和证据。
基因修饰的表达肿瘤特异性TCR的工程T细胞的转化进展证明了这一策略在治疗各种癌症方面的前景。与CAR-T细胞不同，TCR-T细胞已被开发为靶向与MHC相关的多种细胞内和细胞外的肿瘤抗原，这表明肿瘤识别可能带来广泛的治疗益处。然而，尽管临床试验结果提供了重要的概念验证，包括客观的抗肿瘤活性的证明，但对患者的总体好处并不太理想，特别是在实体瘤治疗环境中，低应答率和较差的耐受性仍然是重大挑战。提高疗效的细胞内在策略包括TCR亲和力增强，这可能会改善活性，但往往以限制剂量的不良安全反应为代价。更多的研究表明，治疗失败可能是由于体内T细胞活化不足、初始植入不良、持久性有限以及T细胞抗肿瘤功能的多重弱点造成的，而不是TCR结合亲和力不佳。因此，促进在体内向TCR-T细胞传递全面刺激信号的策略可能是使临床进一步成功的关键。
已经报道了许多方法来增强体内T细胞的功能，包括直接对促炎分子进行基因编码，促进T细胞内在或抗肿瘤免疫生物学方面，通过联合治疗提供这些药物，或者通过纳米载体或其他方式的细胞修饰使T细胞配备外源支持或调节因子。虽然这些策略已经显示出提高疗效的潜力，但它们提供了一个有限的机会来补充内在复杂和多因素的生物学基础，这些内源性机制有助于有效的T细胞启动，而T细胞启动对有效的抗肿瘤反应至关重要。在体内协同促进这些机制，包括刺激TCR-信号复合体，传递共刺激信号，以及细胞因子支持，能够最终靠疫苗有效地触发先天免疫反应，同时传递激活和支持效应器T细胞强大的激活和功能所需的全面和复杂的信号。对于这一目的，基于TCR的特异性表位疫苗是非常着迷的，它提供了同源多肽免疫原的简单的TCR信息设计。然而，由于它们的小分子尺寸，已知的常规多肽免疫原性差，因为在由常驻抗原提呈细胞(APC)协调适应性免疫的淋巴结中缺乏有效的积聚和滞留。以前的研究已经证明，利用两亲性(AMP)结合疫苗开发了白蛋白“基因便车”，这种疫苗促进了疫苗有效载荷进入淋巴结的稳定性和特异性运输和保留。以这种方式，多肽抗原和促炎分子佐剂都可以偶联到亲脂的白蛋白结合域，这些结合域在给药后与注射部位的内源性组织白蛋白非共价结合(图1A)。这些AMP白蛋白复合体限制疫苗成分进入全身血液循环，从而使分布远离淋巴管，优先将白蛋白结合的药物重新定位到淋巴结。由常驻APC产生的摄取可以随后启动同源肽和共刺激配体与细胞因子分泌的协同呈现，以有效地激活和许可体内的T细胞。
鉴于AMP疫苗可以轻松又有效地扩大内源性效应T细胞反应，这里推测可以设计类似的方法来加强TCR-T细胞治疗对体内已建立的实体瘤的治疗。使用这种方法，传统的肿瘤特异性TCR-T细胞的收集、激活、遗传编辑和回输可以与AMP疫苗接种相结合，包括匹配的同源肽和佐剂(图1B)。给药后，通过淋巴管迁移的TCR-T细胞可以在这些解剖部位独特的支持性免疫微环境中与高度共刺激的、同源多肽递呈的APC群体共存。通过接种AMP疫苗，协同传递TCR刺激、内源性共刺激和细胞因子支持，可以轻松又有效地促进TCR-T细胞的激活、扩增，并按需增强体内的抗肿瘤效应功能。这也允许建立用于诱导抗原传播的支持性淋巴利基，以多样化对肿瘤特异性靶点的免疫识别，以促进持久的完全缓解和长期保护。在这里，利用多种TCR-T细胞模型的证据来展示有效的淋巴结靶向AMP疫苗提供的独特增强，包括对APC的影响，以支持TCR-T细胞的体外激活和扩增，增强肿瘤侵袭，以及在同基因小鼠模型中根除已建立的实体瘤。随后，展示了AMP多肽驱动的针对临床相关肿瘤靶点的人TCR-T细胞的潜在增强作用，表明该策略在临床转化时提高TCR-T治疗活性的可能性。
已知多肽抗原和分子佐剂的AMP修饰通过白蛋白“基因便车”促进淋巴传递和滞留，从而有效地扩大同源内源性T细胞反应。在这些发现的激励下，设计一种针对淋巴结的疫苗接种方案，用于过继转移同源TCR-T细胞治疗，以提高对已建立的实体瘤的治疗效果。野生型C57BL6(WT)小鼠皮下接种5×10^5 B16F10黑色素瘤细胞10天，肿瘤大小为40-70 mm^3。然后在第10天给予激活的mCherry转导的肿瘤特异性Pmel-1 TCR-T细胞，而不需要任何预先条件或外源性细胞因子补充。TCR-T细胞治疗单独或与多剂量疫苗强化方案联合使用，该方案由同源gp100长肽和CpG佐剂组成(图2A)。为了确定淋巴靶向对TCR-T细胞有效免疫的重要性，比较了未修饰的可溶性多肽(SOL)和佐剂与AMP修饰的疫苗成分。与单独或与SOL疫苗联合接种TCR-T细胞的小鼠相比，AMP疫苗联合TCR-T细胞输注治疗的小鼠肿瘤生长显著延迟或完全根除(图2B)；因此，AMP疫苗接种的小鼠明显提高了长期存活率，无显著的体重减轻迹象(图2C)。AMP联合治疗动物的抗肿瘤效果的增强进一步与治疗后荷瘤动物外周血中TCR-T细胞的数量增加和维持的时间长达75天有关(图2D)。重要的是，尽管TCR-T细胞数量扩增，AMP疫苗联合治疗并没有导致全身炎症细胞因子的显著水平，表明有可能发生细胞因子释放综合征。在另一项研究中，早期TCR-T-AMP-疫苗联合治疗B16F10肿瘤仅建立了7天，而TCR-T细胞治疗单独或与SOL比较器联合治疗同样无效。
为了评估进一步预防复发的可能性，先前接受TCR-T细胞和AMP疫苗治疗并获得长期存活的小鼠在T细胞治疗75天后与幼稚对照组一起被植入二次B16F10肿瘤攻击。所有长期存活的小鼠都表现出持续的TCR-T细胞持久性，与肿瘤生长迅速需要安乐死的幼稚对照组相比，拒绝继发肿瘤的生长(图2E-F)，证实了TCR-T细胞与AMP疫苗的结合在同基因小鼠模型中诱导了对实体瘤再攻击的持久保护。
鉴于AMP疫苗联合TCR-T细胞治疗晚期实体瘤的体内疗效增强，使用in vitro和ex vivo分析从机制上理解这种联合作用。虽然in vitro评估不能完全捕捉体内活动的关键机制过程，但ex vivo分析提供了一个机会来评估AMP介导的对淋巴聚集和滞留的贡献，以及位于TCR-T细胞附近的APC在体内循环时对同源肽的有效摄取、处理和呈递。在in vitro，小鼠DC与SOL-或AMP-gp100肽孵育，然后与先前激活的、转导的和静息的同源TCR-T细胞培养，以确定其增强TCR-T细胞效应功能的效果(图3A)。与单独培养的T细胞或模拟脉冲的DC相比，TCR-T细胞与SOL或AMP多肽脉冲的DC培养产生的促炎IFNγ水平明显高于单独培养的T细胞(图3B)。与模拟脉冲的DC或未处理的对照T细胞相比，SOL和AMP多肽脉冲的DC诱导了TCR-T细胞的表达以及CD25和CD69激活标记的共同表达(图3C)。在TCR-T细胞对B16F10肿瘤靶细胞的杀伤和效应功能方面也观察到类似的增强。在这里，与未经处理或暴露在模拟脉冲DC中的TCR-T细胞相比，经AMP脉冲和较小程度的SOL脉冲的DC刺激的TCR-T细胞显示出对B16F10肿瘤靶点的特异性裂解(图3D)和相关的IFNγ的分泌(图3E)。这一些数据表明，在in vitro，SOL-肽和AMP-肽都可以在一定程度上促进DC介导的TCR-T细胞功能的增强。正如预期的那样，考虑到in vitro评估的局限性，这些趋势与之前观察到的体内SOL和AMP疫苗的抗肿瘤活性的相对增强并不完全一致。
因此，为了更好地了解AMP驱动的淋巴靶向在体内TCR-T细胞疫苗接种中的作用，设计了一种ex vivo方法，即在接种包括gp100肽的模拟疫苗、SOL疫苗或AMP疫苗24h后从肿瘤初生鼠身上获取腹股沟淋巴结。从采集的淋巴结中提取的单个细胞悬液随后与先前激活的、转导的和静息的TCR-T细胞以1:1的比例共培养(图3F)，然后评估TCR-T细胞的激活、细胞毒性和效应器功能。正如先前的in vitro评估所观察到的，在第2天和第8天，用AMP疫苗接种的小鼠的淋巴结单细胞悬液培养的TCR-T细胞上清液中包括IFNγ和TNFα在内的促炎细胞因子水平明显高于对照条件(图3G)。然而，从SOL疫苗接种的小鼠分离的淋巴结是不活跃的，这与先前的研究一致，表明可溶性多肽免疫原和分子佐剂在淋巴中积累较少。用AMP疫苗的淋巴结单细胞悬液培养的TCR-T细胞比用模拟或SOL疫苗的淋巴结细胞培养的TCR-T细胞的T细胞活化状态和增殖明显地增强(图3H-I)。最后，AMP疫苗接种小鼠的淋巴结细胞悬液的ex vivo培养使TCR-T细胞在一周后能够执行强大的抗肿瘤细胞毒性，与暴露于模拟或SOL疫苗接种的或未处理的TCR-T细胞相比，在不同的效靶比下，TCR-T细胞具有非常明显更高的特异性肿瘤杀伤作用(图3J)。这些ex vivo数据与淋巴输送和有效的APC获取和提呈抗原以激活同源T细胞的先前相关性一致，支持假设，即AMP疫苗的淋巴转移是促进体内多轴TCR-T细胞功能的重要机制。这些结果进一步证明了为什么SOL-肽疫苗在in vitro有效地增强了TCR-T细胞的活性，但在体内却未能诱导类似的TCR-T细胞抗肿瘤反应的增强。
鉴于AMP疫苗接种的淋巴结单细胞悬液ex vivo对TCR-T细胞的刺激作用，在体内研究了AMP疫苗对TCR-T细胞和体内APC的影响，以了解淋巴结激活与抗肿瘤活性之间的关系。与以前一样，将B16F10肿瘤细胞移植到WT小鼠皮下10天后，单独或接种激活的、转导的肿瘤特异性TCR-T细胞或接种SOL或AMP疫苗，然后在7天后收集淋巴结(图4A)。流式细胞仪分析显示，虽然SOL疫苗接种无效，但与模拟或SOL疫苗接种的动物相比，AMP疫苗诱导的淋巴结驻留TCR-T细胞数量明显地增加(图4B)。此外，接种AMP的淋巴结内的CD8+T细胞在体外用gp100肽刺激后，在对肿瘤特异性抗原的反应中分泌促炎细胞因子的功能更强(图4C)。这些发现与先前观察到的AMP免疫的淋巴结单细胞悬液体外刺激的TCR-T细胞以及已知的SOL与AMP免疫原的相对淋巴靶向效率一致，表明AMP疫苗对体内过继转移的T细胞具有类似的作用。
以前的研究表明AMP多肽和佐剂有效地转运到淋巴结，假设APC在淋巴结中的协同激活和抗原递呈可能是观察到的淋巴诱导T细胞扩增和效应器功能获得改善的关键机制。事实上，观察到AMP疫苗接种诱导了CD11c+DC总数的明显地增加，以及在开始TCR-T细胞治疗一周后，淋巴结中表达共刺激或抗原提呈标记CD40+、CD80/CD86+或MHC Class II+的激活DC的数量显著增加(图4D-G)。相比之下，从SOL疫苗接种的小鼠的淋巴结中收集的DC总数和DC数量显著增加，但显著减少，这些DC显示出各种激活标志。这些发现与对TCR-T细胞数量和功能升高的观察结果相关联，表明了有效的淋巴佐剂靶向对于使表位疫苗方案的活性能够增强TCR-T细胞过继治疗的关键重要性。
为了更广泛地评估淋巴结室的不同激活状态和TCR-T细胞疗法、SOL或AMP疫苗接种或两者结合的相对贡献，从如前所述收集的淋巴中提取RNA，并由561基因的小鼠免疫小组做多元化的分析，以执行对淋巴结转录组的无偏分析。为数据集计算Z分数，并基于基因本体分类对基因进行聚类和绘制(图4H)。与使用和不使用TCR-T细胞输注的SOL疫苗相比，AMP疫苗提高了与炎症、免疫激活和抗原呈递相关途径的大量基因转录，同时避免了与T细胞无能或功能障碍相关的基因特征。上调的转录本包括共刺激分子CD40和CD86，炎症性IL12b，IFNg和GZMB，以及与抗原提呈相关的TAP1和TAPBP。重要的是，这些致炎基因的相对表达增加与转录上调或通常涉及免疫调节机制、T细胞无能或衰竭的途径无关，包括FoxP3、CTLA4和Ceacam1。总之，这一些数据加强了观察到的结果，即AMP疫苗接种有效地诱导了众多和全面的免疫机制，对于支持和加强淋巴结内的T细胞启动至关重要。
AMP疫苗增强TCR-T细胞在肿瘤微环境中的渗透和功能，并导致针对不一样肿瘤靶点的表位扩散
已经证明，AMP疫苗增强了TCR-T细胞治疗的荷瘤小鼠的抗肿瘤反应，并且这种效果与有效的AMP多肽介导的体内淋巴结激活和与可溶性对照相比在引流淋巴结中的佐剂积聚有关。进一步试图通过观察过继转移的TCR-T细胞和从肿瘤实质中分离的内源性T细胞的特征，来评估AMP疫苗诱导的淋巴结反应和肿瘤自身抗肿瘤免疫活性之间的联系。和以前一样，在小鼠中建立B16F10肿瘤，在治疗前10天使用激活的、转导的、肿瘤特异性的TCR-T细胞，以及在7天后处死和切除肿瘤之前采用模拟疫苗、SOL疫苗或AMP疫苗组合方案(图5A)。对肿瘤样本产生的单细胞悬液的流式细胞仪分析表明，与接受模拟或SOL疫苗接种方案的小鼠相比，接受TCR-T细胞治疗和AMP疫苗接种方案的小鼠的肿瘤过继转移的TCR-T细胞的渗透率显著更高(图5B)。此外，免疫动物的肿瘤浸润性T细胞(包括内源性和转移性)更加活跃、增殖和功能更强，如CD25、Ki67或IFNγ和颗粒酶B的表达(图5C-E)。尽管先前的观察表明，SOL疫苗接种可以推动淋巴结DC数量和激活状态的适度改善，但与单纯TCR-T细胞治疗相比，这些并不能转化为肿瘤浸润性T细胞反应的显著改善。有必要注意一下的是，AMP-疫苗组合有效地诱导了肿瘤T细胞的增强渗透和整体适应性，与T细胞的过度激活或耗尽无关。虽然观察到PD-1激活标记上调，但这并没有伴随着PD-1/TIM-3/LAG-3双重或三重阳性T细胞的增加，这表明T细胞功能障碍。
然后，对肿瘤微环境进行了无偏见的转录组分析，以更广泛地检查单独使用TCR-T细胞治疗与联合接种AMP疫苗相关的免疫图谱的变化(图5F)。相对于TCR-T细胞单一治疗动物的肿瘤，从TCR-T细胞、AMP-疫苗组合治疗的小鼠分离的肿瘤样本显示出许多基因转录上调，这些基因转录有助于免疫细胞激活的多个轴。具体地说，AMP疫苗导致与T细胞激活、IFN信号、T细胞增殖和MHC呈递相关的转录上调。例如，AMP疫苗联合治疗后，与T细胞激活相关的转录如Tnfrsf9(4-1BB)和CD80，效应T细胞归巢趋化因子如CXCL10和CXCL9，以及T细胞增殖如IL18或Il15Ra显著上调。正如在相关的淋巴结分析中一样，发现这些不同的免疫激活和炎症转录产物，包括PDCD1(PD-1)的上调，并没有伴随着调节转录产物或与T细胞无能、功能障碍或肿瘤促进相关的过程的增加，如FoxP3、Ceacam1或Bcl6。结合AMP疫苗依赖诱导T细胞渗透和适应性改善的观察，这些根据结果得出，与AMP疫苗驱动的淋巴激活相关的局部肿瘤免疫微环境发生了更全面的变化。
图5 AMP疫苗增强了活化和增殖的TCR-T细胞的渗透，同时诱导炎性转录重编程，并在肿瘤微环境中扩散表位。
虽然AMP疫苗体内过继转移的TCR-T细胞的激活是驱动抗肿瘤活性的重要的条件，但假设AMP疫苗诱导的淋巴结激活可能同时促进针对其他非靶向肿瘤相关或新抗原表位的内源性T细胞反应。为了研究这一点，来自不同治疗组的肿瘤样本被一组先前报道存在于B16F10突变组中的多肽刺激，并通过流式细胞仪检测效应细胞因子的产生来评估同源T细胞的存在。与TCR-T细胞单独治疗或SOL疫苗接种组相比，TCR-T细胞与AMP疫苗联合治疗的小鼠肿瘤显示出更多的浸润性、肿瘤抗原性T细胞(图5G-I)。AMP疫苗通过内源性肿瘤特异性T细胞诱导的肿瘤侵袭增加，表明这一机制可能在促进更广泛、更有效的抗肿瘤疗效和持久保护肿瘤进展方面发挥作用，这些作用是由抗原丢失或异质性驱动的。为了确定内源性T细胞对肿瘤相关抗原和新抗原的许可对抗肿瘤效应的贡献，先前通过TCR-T细胞和AMP疫苗治疗克服B16F10皮下肿瘤的小鼠在与B16F10肿瘤细胞二次攻击之前耗尽了过继转移的Thy1.1 TCR-T细胞。与先前观察到的具有充分TCR-T记忆细胞反应的宿主动物对二次挑战的完全排斥一致，过继转移的TCR-T细胞耗尽的宿主小鼠亚群显示出完全的肿瘤排斥反应，而其他小鼠则显示出延迟的、但进展的肿瘤生长(图5J-K)。这一效应既说明了在内源性T细胞库中传播的表位对促进整体抗肿瘤活性的贡献，也说明了AMP疫苗在同基因小鼠肿瘤模型中支持这一机制的潜力。
AMP疫苗诱导野生型和HLA表达小鼠体内淋巴DC活化和增强突变型KRAS(mKRAS)特异性TCR-T细胞应答
为了进一步评估AMP疫苗增强代表人类疾病转化候选的TCR-T细胞的潜在活性和机制，在一个转基因小鼠品系中进行了淋巴运输、APC激活和mKRAS特异性TCR-T细胞的激活的研究，该转基因小鼠通过匹配的人HLA、TCR参与有利于TCR-T细胞的启动。首先探索了用FITC标记、SOL-或AMP-mKRAS-G12D多肽免疫原等疫苗治疗的WT小鼠的淋巴靶向性。治疗24h后采集腹股沟和腋窝淋巴结，并进行体外成像以获得与多肽相关的荧光信号(图6A)。接种AMP疫苗的动物在局部和远端引流淋巴结中的多肽积累增加，突出了传统可溶性多肽相对缺乏的淋巴暴露，以及AMP修饰诱导针对多个区域不同淋巴结组的强大淋巴传递的能力。对淋巴结分离株的流式细胞术分析证实并扩大了这些发现，显示驻留于淋巴结的DC和巨噬细胞的比例明显地增加，同时获得FITC标记的多肽，并显示APC激活的标记，CD80和CD40。相比之下，SOL疫苗接种的抗原和共刺激标志物阳性的淋巴结APC群没有增加(图6B-E)。这一些数据证实了临床上相关的AMP多肽比传统的可溶性多肽更有效地运输到引流淋巴结。这一发现使其研究了这些多肽是否诱导了TCR-T细胞的植入、激活表型和效应功能，这些都是在临床相关的表达HLA的小鼠系统中实现的。
图6 AMP疫苗可增加野生型和A*11:01转基因小鼠体内活化和功能性mKRAS特异性TCR-T细胞的数量。
用针对临床相关的mKRAS-G12D或-G12V多肽表位的双顺反子TCR-mCherry转导供体小鼠T细胞，并与含有同源多肽免疫原的模拟、SOL或AMP免疫方案相结合地注入未成熟的HLA-A*11:01+宿主小鼠。正如之前在WT小鼠中观察到的那样，只有AMP疫苗接种才能明显地增加淋巴结APC的激活，与模拟或SOL疫苗接种方案相比，观察到CD80/CD86+和MHC Class II+激活的DC数量增加(图6F)。接种AMP疫苗后，淋巴结和外周血中的TCR-T细胞总数明显地增加，CD25+/CD69+TCR-T细胞被激活(图6G-J)，这与AMP疫苗诱导的TCR-T细胞在淋巴结中的启动、扩增和激活一致，支持了循环中TCR-T细胞数量的增加。TCR-T细胞与AMP疫苗的结合进一步诱导肺内TCR-T细胞数量的增加，这是TCR-T细胞疗法干预人mKRAS驱动的疾病进展的高潜在临床兴趣的组织(图6K)。
除了增强TCR-T细胞的持久性和活化外，TCR-T细胞治疗和AMP疫苗联合接种还增强了TCR-T细胞效应器的多轴功能。经TCR-T细胞联合AMP免疫的小鼠分离的脾细胞产生的IFNγ分泌细胞数量明显高于模拟或SOL疫苗接种的对照组(图6L)。最后，与接受模拟或SOL疫苗接种的动物相比，接受TCR-T细胞和AMP疫苗联合接种的动物显示出针对mKRAS多肽脉冲靶标的体内特异性裂解水平明显高于接受模拟或SOL疫苗接种的动物，说明AMP疫苗接种有可能提高体内临床相关TCR-T细胞的效力(图6M)。
为了探索AMP疫苗促进TCR-T细胞功能的转化相关性，设计了一个in vitro系统，在该系统中，多肽脉冲的自体人DC能刺激激活的、转导的和静息的TCR-T细胞，跨越多个临床相关的肿瘤靶点和HLA单倍型。首先，将NY-ESO-1特异性TCR导入人HLA-A*02:01+T细胞，静息一段时间后，与预先用AMP-NY-ESO-1多肽或赋形剂脉冲的自体成熟的HLA-A*02:01+DC共培养。与未经处理或单独暴露于DC的T细胞相比，暴露于AMP多肽脉冲的DC可显著激活人TCR-T细胞，CD25和CD69共同表达的水平更高(图7A)。与激活标记上调一致，NY-ESO-1特异性TCR-T细胞与AMP多肽脉冲的DC共培养时，与未标记DC培养的T细胞相比，分泌明显更高水平的IFNγ、TNFα和IL-2细胞因子(图7B)。对TCR-T细胞总数的纵向分析表明，AMP-肽依赖的TCR-T细胞显著扩增，记忆表型增加，与同源抗原识别后激活诱导的增殖一致(图7C)。DC共培养后获得活化的TCR-T细胞，并评估其对HLA匹配、抗原阳性的A375 GFP/LUC肿瘤细胞株的细胞毒活性。NY-ESO-1特异性TCR-T细胞在AMP多肽致敏的DC激活后表现出增强的特异性靶点裂解，表明针对表达相关水平的抗原提呈成分和NY-ESO-1蛋白的靶点的每细胞细胞毒力得到一定的改善(图7D)。
图7 AMP多肽脉冲的自体DC体外可增强临床相关的各种特异性的人TCR-T细胞的功能。
这些结果在HPV16 E7和mKRAS-G12D的体外模型中得到了进一步的概括，在该模型中，人的HLA-A*02:01+T细胞或HLA-A*11:01+T细胞分别与HPV16 E7或mKRAS-G12D特异的TCR激活和转导，并在休息一段时间后与预先用AMP-HPV16 E7或AMP-mKRAS-G12D多肽脉冲的DC共同培养。再次看到，暴露于AMP多肽脉冲的自体DC后，TCR-T细胞激活标志物上调，炎性细胞因子分泌，TCR-T细胞增殖改善，细胞毒活性增强(图7E-H)，表明AMP多肽通过对TCR匹配的小肽或长肽进行AMP修饰来增强TCR-T细胞活性的多功能性，而不依赖于抗原特异性。这一结果在评估HLA-A*11：01+/mKRAS-G12V特异性和HLA-C*08：02+/mKRAS-G12D特异性TCR-T细胞与相应的AMP-mKRAS-多肽脉冲的自体DC的相似模型中也观察到。
这些结果清楚地证明了AMP多肽在体外对几个临床相关的TCR-T细胞的刺激作用。然而，与SOL疫苗类似物相比，所使用的体外系统并不能完全解释已知的有助于AMP疫苗体内强大活性的机制，包括淋巴靶向和滞留，以及提高对降解的抵抗力。为了研究增强的体内稳定性在AMP多肽刺激TCR-T细胞活化中的作用，在体外将AMP多肽和SOL比较器暴露于体内模拟条件(人血清，37℃)，然后脉冲自体DC与TCR-T细胞共同培养。在这些条件下，与AMP多肽脉冲的DC共同培养的TCR-T细胞在暴露于模拟的活体条件下后，诱导TCR-T细胞激活、细胞因子分泌或特异性靶点溶解的能力没有显而易见地下降(图7I-K)。相反，在体内模拟条件下，SOL-肽的活性明显降低或完全消融，这与已知这些试剂对组织中丰富的被动或酶降解过程的敏感性一致。这一效应对mKRAS-G12V多肽和G12V特异性TCR-T细胞进行了概括，以显示其在TCR构建体和多肽表位之间的一致适用性。结合先前的观察，这些结果突出了限制传统多肽免疫原潜在活性的另一个挑战，并证明了AMP修饰可以克服这一限制以增强体内TCR-T细胞的启动和效应器功能的机制。
为了研究in vitro增强临床相关的mKRAS特异性TCR-T细胞是否导致体内抗肿瘤效果增强，首先在体外将人TCR-T细胞与AMP多肽或模拟脉冲的自体DC共同培养，然后Panc-1(HLA-A*11:01+，mKRAS-G12D+)荷瘤NSG小鼠。由于NSG小鼠缺乏完整和有能力的免疫系统，特别是AMP疫苗作用机制所必需的功能淋巴结，输注前在体外增强了TCR-T细胞。给10天龄的Panc-1荷瘤NSG小鼠输注模拟转导或mKRAS-G12D特异性TCR-T细胞，这些细胞是从与模拟或AMP多肽脉冲的DC共培养的过夜中分离出来的，并跟踪肿瘤的进展。于移植瘤后第35天切除肿瘤，分析肿瘤质量、TCR-T细胞的浸润和活化情况。只有mKRAS-G12D特异性TCR-T细胞与AMP多肽致敏的DC相结合才能显著减少终点肿瘤质量(图7L)。相应的肿瘤样本分析显示，体外暴露于AMP多肽脉冲的DC的TCR-T细胞也显示出显著更高的肿瘤浸润率(图7M)，更高的T细胞激活水平(图7N)，以及缺乏耗竭表型。这一些数据表明，DC介导的AMP多肽暴露促进了与增强的抗肿瘤反应相关的临床相关TCR-T细胞的激活和实体瘤的侵袭。
尽管总体应答率不高，耐受性有限，但TCR-T细胞疗法的显著治疗潜力表明，这一些方法的优化可能会对许多以前难以治愈的实体瘤产生广泛的治疗益处。在其他相关因素中，TCR-T细胞治疗的临床失败与TCR-T细胞植入和持久性差有关，这可能归因于体内缺乏T细胞激活信号。这里已经证明，TCR-T细胞治疗与同源多肽AMP疫苗的结合可以明显地增强抗肿瘤效果，包括在相当一部分动物中长期无进展和抵抗二次肿瘤攻击。这与TCR-T细胞数量、持续性、肿瘤浸润性和功能的增加有关，与以前的临床前和临床报告一致，该报告认为功能性T细胞动力学与更好的总体存活率有关。
已经开发了多种策略来提高TCR-T细胞疗法的治疗潜力，包括对T细胞内在生物学进行基因改造，使其超过重新设计的TCR特异性，以及开发包括支持性外源细胞因子或其他因素的联合方案。细胞因子或其他共刺激分子，如IL-12、IL-15、IL-18或CD40L可被包括在TCR表达盒中，产生具有增强生存和抗肿瘤能力的“装甲”TCR-T细胞。或者，TCR-T细胞的植入和持久性能够最终靠在联合方案中外源性提供细胞因子，如IL-2或IL-15，或通过细胞因子“背包”直接修饰T细胞来增强。虽然这些治疗方法有很大的前景，但也有挑战和局限性。外源性细胞因子补充是一种非特异性治疗，具有潜在的有害毒性，在实践中往往因血清半衰期短和治疗指数不足而进一步复杂化。或者，装甲TCR-T细胞促炎分子的结构性表达试图限制与全身暴露相关的潜在毒性；然而，潜在的不良副作用任旧存在，常常要额外的基因修饰以确保安全性。相比之下，免疫具有重复给药的好处，有可能是在体内安全、按需增强工程T细胞，为支持长期T细胞功能持久性提供机会。在携带同基因肿瘤的小鼠中，重复注射AMP疫苗耐受性良好，与TCR-T细胞联合治疗没有观察到明显的毒性。先前的评估表明，AMP靶向的淋巴结传递能够大大减少潜在的毒性全身炎症，而强效佐剂由于通过血液从注射部位的主要清除而被观察到。在TCR-T细胞结合的背景下，AMP疫苗提供了强大的TCR-T细胞激活和扩增的可能性，但将这一过程限制在淋巴结可能提供了另一种安全措施，防止广泛暴露于与潜在毒性相关的炎性细胞因子。最后，将TCR-T细胞疗法与AMP疫苗相结合，在不需要传统的预适应方案或外源细胞因子补充的情况下，明显提高了抗肿瘤效果，这表明AMP疫苗有可能取代这些标准实践中的要素，但这一些要素仍然与潜在的安全问题相关，并将临床实践限制在愿意并可接受预适应疗法的患者。
总体而言，下一代基因工程战略或外源因子组合方案侧重于有明确的目的性地提供具有强大但潜在狭窄生物学影响的选定单一制剂。虽然这些策略显示出了希望，但它们本身就缺乏充分的利用APC在天然T细胞启动过程中使用的激活机制的能力。此外，虽然这些策略能够在一定程度上促进改善TCR-T细胞植入和功能持久性的目标，但它们本质上或设计上仅限于增强具有单一或多肿瘤特异性的过继转移细胞，因此它们解决肿瘤免疫逃逸的可能机制的能力有限。通过接种同源多肽疫苗能轻松实现更全面的T细胞激活，以广泛参与已知的机制，以扩大和增强由APC刺激的T细胞的功能。在体内，接种AMP疫苗可明显地增加活化的淋巴结驻留DC。这些细胞在体外暴露于淋巴结细胞悬液中，可明显地增强TCR-T细胞的生物学活性，包括激活、增殖、效应功能和每细胞对肿瘤的杀伤能力。在血液、淋巴结和肿瘤实质中观察到的TCR-T细胞在体内也有类似的益处，对应于增强的整体抗肿瘤效果。对淋巴结转录本的评估进一步揭示了AMP疫苗所驱动的免疫调节效应的广度。在这里，与T细胞激活和共刺激相关的许多基因和通路的显著增强，以及抗原递呈和细胞因子信号转导，表明AMP疫苗诱导的一整套促炎信号，并在最佳的淋巴结微环境中可被TCR-T细胞获得。
虽然在TCR-T细胞治疗的临床研究中观察到了显著的抗肿瘤反应，但获得肿瘤固有的逃逸机制，如抗原丢失或抗原递呈机制下调，即使在成功植入过继转移的TCR-T细胞的患者中也会导致肿瘤进展。因此，能够改善TCR-T细胞植入和功能持久性的策略是着迷的，但如果不与克服肿瘤免疫逃逸机制的努力同时采用，则可能是有限的。已知肿瘤抗原在肿瘤形成过程中脱落或在治疗过程中释放，在引流的淋巴结内积累，如果被免疫反应正确捕获和呈现，则代表了指导突变体特异性适应性免疫的潜在的强大信息源自。在这种情况下，疫苗接种导致内源性APC隔室的佐剂介导的激活，提供了与过继转移的细胞一起启动肿瘤特异性内源性记忆或幼稚T细胞的机会，从而扩大了可用于抗肿瘤作用的效应细胞库。除了对同基因荷瘤小鼠过继转移的TCR-T细胞数量的影响外，发现AMP疫苗还支持细胞因子分泌的内源性肿瘤浸润性T细胞的扩增，这些T细胞是针对非靶向的、但与肿瘤相关的抗原的。进一步观察了TCR-T细胞和AMP疫苗处理的小鼠对抗原扩散的诱导，以提供对过继转移的T细胞耗尽的小鼠的部分保护，使其免受二次肿瘤再攻击。这些观察根据结果得出，AMP疫苗诱导的抗原扩散有利于使抗肿瘤免疫反应多样化，提供潜在的关键保护，防止肿瘤免疫通过突变抗原丢失或下调而逃逸。
虽然疫苗组合有望解决许多被认为限制TCR-T细胞治疗效果的固有问题，但包括未经修饰的分子佐剂和常规多肽在内的疫苗组件未能成功地运输和刺激APC：T细胞相互作用所在的淋巴结中的免疫细胞。若无法有效地获取和激活淋巴结内的APC，这些疫苗就不能有效地使过继转移的或内源性T细胞在这个有效和独特的免疫部位发挥作用。相比之下，有效的淋巴结靶向能轻松实现更有效的APC：TCR-T细胞的参与和AMP佐剂的淋巴输送具有重新编程常驻天然免疫的潜力，以促进内源性T细胞对被动积聚在肿瘤引流淋巴结中的肿瘤抗原的反应。在所有报道的研究中，未修饰(可溶性)和AMP疫苗组之间的比较已经证明了有效的淋巴结输送的重要性，以及传统的分子佐剂和免疫原在淋巴结靶向方面的固有缺陷。此外，与以前的报告一致，观察到的可溶性多肽在模拟体内条件下对降解的敏感性对其在体内的实用性提出了重大的额外挑战，而AMP修饰给予了导致多肽完整性丧失的机制的完全抵抗。综合证据说明，通过AMP靶向的疫苗递送在淋巴结中实现强大的TCR-T细胞激活对于提高TCR-和内源性T细胞的活性至关重要，这依赖于全面的免疫参与，从而大幅度的提升了治疗效果。
经过在同基因小鼠系统中的评估，证明这种治疗方式能很容易地适应和应用于增强临床相关的TCR-T细胞治疗的活性。为此，利用小鼠的HLA转基因模型以及体外和体内的人TCR-T细胞实验系统来证明AMP疫苗接种和TCR-T细胞治疗的组合具有直接的临床相关性。用TCR-T细胞联合AMP疫苗治疗的HLA转基因小鼠保持了相当高的持续TCR-T细胞群水平，并显示出增强体内多肽脉冲靶标的特异性裂解，说明AMP疫苗在体内提高临床相关TCR-T细胞的疗效的潜力。在一系列与NY-ESO1-、mKRAS-和HPV16 E7-靶向的人TCR-T细胞相匹配的人类系统中，AMP-多肽还被证明能够增强多种关键的T细胞特性，如激活、增殖、细胞因子的分泌和每细胞特异性的肿瘤溶解功能，说明这种方法在增强各种特异性的TCR-T细胞方面的灵活性。此外，在了解TCR同源多肽序列的基础上，快速设计和简单制造匹配的AMP多肽的能力使这种方法应用于临床评估与现有或正在进行的TCR-T细胞疗法相结合是可行的，而不需要对现有的制造工艺进行任何修改。
先前对疫苗与过继细胞疗法相结合的研究表明，这种方法有望提高对实体瘤的抗肿瘤效果。用肿瘤特异性CARs转导内源性抗病毒T细胞，能够最终靠免疫正交病毒抗原来增强这些细胞在体内的活性。虽然这一些方法有力地证实了接种疫苗有效地增强肿瘤重定向T细胞治疗的潜力，但它们仍然依赖于每一种潜在的新应用的复杂和定制的多顺反子基因重新编程。如果应用于TCR-T细胞治疗，这将进一步复杂化，在TCR-T细胞治疗中，肿瘤和病毒特异性TCR亚单位的错配将是一个挑战，双重HLA限制可能会限制可接触到的患者。或者，多个小组报告的通过嵌合受体直接增强CAR-T细胞的疫苗提供了一种有效和简化的方法。有必要注意一下的是，在这些研究中，疫苗诱导的次级淋巴组织中内源性APC的活性与CAR-T细胞活性的增强以及内源性抗原扩散反应的诱导相关，这与观察结果一致，证明了淋巴APC对于增强TCR-和内源性T细胞活性的重要性。综上所述，疫苗与T细胞治疗组合潜力的先前证据，有效淋巴APC参与的重要性，以及直接针对肿瘤特异性TCR的疫苗的相对实用优势表明，AMP疫苗接种是TCR-T细胞治疗的一种有前途的组合策略。
综上所述，TCR-T细胞治疗与AMP疫苗接种相结合可促进全面的淋巴免疫激活，从而增强TCR-T细胞活性并促进内源性抗肿瘤T细胞应答，从而改善实体瘤的根除并持久防止复发。评估mKRAS特异性AMP疫苗的临床试验(NCT04853017)正在进行中，为AMP淋巴结靶向技术的未来临床应用奠定了基础。TCR同源多肽序列的简单AMP修饰为临床TCR-T细胞治疗提供了广泛和快速应用的诱人潜力，潜在地增强TCR-T细胞功能，促进持久和全面的抗肿瘤免疫反应。
