在正常大脑发育和神经退行性变中，半胱天冬酶（caspase）途径启动的细胞凋亡发挥着及其重要的作用，而最近，caspase激活慢慢的变多地与生理和病理非凋亡结果相关，激活caspase途径可以触发细胞内非凋亡事件并产生多种作用，包括免疫功能、细胞增殖和分化、细胞命运规范和细胞骨架功能。
细胞凋亡通常由半胱天冬酶（caspase）途径启动，其在正常大脑发育和神经退行性变中也发挥着及其重要的作用，保守进化的非典型、非致命性caspase途径，也与这两个过程有关，但研究相对较少。暴露于环境神经毒素或麻醉剂等化合物可导致通路激活失调，可能会对大脑成熟和行为产生长期影响。在这篇综述中，我们讨论了非典型caspase途径的关键分子特征和作用，以及其失调如何对大脑发育产生不利影响。我们强调基因、环境和非致死性caspase途径调节凋亡的因素，并讨论针对非典型caspase途径治疗发育性脑损伤的潜在干预措施。
细胞死亡目前被认为以四种形态学上的方式发生：凋亡、自噬、坏死和内吞。凋亡作为一种内在的程序性现象最初在秀丽隐杆线虫中描述，在秀丽隐杆线个是遗传上预定的神经元细胞，然而，额外产生了131个细胞，这些细胞在每只蠕虫的发育过程中都会经历程序性细胞死亡，并具备极高的时间保真度。与秀丽隐杆线虫不同，哺乳动物的发育依赖于更随机的细胞消除过程。凋亡机制由半胱天冬酶、半胱氨酸蛋白酶协调底物。
Caspases分为起始型caspases，如caspase2、8、9和10，在凋亡过程中首次催化具有活性的效应型caspase3、6和7，其激活可介导程序性细胞死亡的最终步骤，使DNA断裂，最终致细胞死亡。细胞凋亡通过外源性凋亡途径或基于线粒体的内源性途径诱导死亡受体，外源性caspase激活触发因素涉及包括肿瘤坏死因子－α(TNF-α)和Fas与死亡受体的结合，而内源性线粒体机制是由于DNA损伤和/或过量活性氧的产生启动的（图1）。
重要的神经发育和损伤反应作用已经被描述为经典凋亡途径。最近，caspase激活慢慢的变多地与生理和病理非凋亡结果相关，这些结果不会导致神经元细胞死亡，但对细胞形态和功能有重大影响。已知caspase激活状态和催化效率受酶本身及其底物的磷酸化影响。目前尚不清楚caspase激活及向非凋亡信号转换是否主要根据caspase磷酸化和/或切割的水平（图1和2），或者其他信号途径的调节（图1）。还不清楚这种caspase活性的变化如何将神经元从典型的凋亡转移到结构凋亡。
神经元结构对功能性脑回路的组成至关重要，几乎所有神经元结构的破坏都与神经发育障碍、年龄相关的神经退行性变以及各种脑损伤情况有关。已知caspases通过细胞骨架重塑神经元树突，具有系统发育上的保守作用，并已被证明有助于突触可塑性。此外，在之前的研究中，caspase信号与兴奋性毒性损伤有关，有报道程序性细胞死亡和神经退行性变出现在发育性脑损伤中，如麻醉暴露和酒精诱导的神经毒性。过度的非凋亡caspase的神经毒性潜在信号传导在发育中的大脑中尚未得到很好的表征。考虑到外因（如挥发性麻醉剂、乙醇和阿片类药物）激活半胱天蛋白酶的能力，对解决非凋亡性亚致死性神经毒性的可能尤为重要。
在这篇综述中，重点介绍了神经元发育和成熟过程中非凋亡半胱天冬酶的关键功能，以及它们在发育性脑损伤触发病理过程的作用。我们总结了最新发现的非凋亡半胱天冬酶途径如何长期导致神经功能损伤，并讨论了其潜在的治疗途径。
除了典型的凋亡途径，激活半胱天冬酶途径可以触发细胞内非凋亡事件并产生多种作用，包括免疫功能、细胞增殖和分化、细胞命运规范和细胞骨架功能。在黑腹果蝇中，哺乳动物启动子 caspase 9/2（称为dronc），通过对增殖－分化的非致死性调控，限制肠母细胞（一种肠道前体细胞）的扩展。在黑腹果蝇的中枢神经系统中，dronc起着类似的作用，以非凋亡方式抑制过量感觉神经前体的产生，从而在系统水平对细胞分化过程进行微调。哺乳动物神经干细胞的正确分化也需要非凋亡半胱天冬酶信号，例如，小脑颗粒神经元和伯格曼胶质细胞的分化受caspase3的非凋亡途径的精确控制。考虑到啮齿类动物小脑皮层在出生后第一周内广泛存在的 caspase 依赖性凋亡，核心问题是caspase3的两种不同的功能是如何在时空上协调的，一种可能的解释是取决于caspase3切割水平（图1和图2）。为了验证这一假设，可以在不同的神经元细胞系中引入在可变强度合成启动子控制下编码催化活性caspase 3亚单位的表达构建体。该策略也能够适用于体内神经元分化和成熟的不同阶段，使用组织和细胞特异性启动子，以阐明活性caspase 3的水平是否决定了从非凋亡到凋亡途径的转换。
非凋亡性caspase 信号传导的主要靶点之一是细胞骨架。一些早期的关于caspase 功能研究的重点是了解典型的细胞死亡途径，涉及caspase 在细胞骨架蛋白（如肌动蛋白和tau）的失稳和裂解。细胞骨架的重塑和重组是细胞形态变化的基础，如在细胞分裂、运动和获得成熟形态期间，在神经发育过程中，轴突引导过程是建立正确的早期接线模式和随后的突触成熟的必要条件，抑制小鼠海马神经元中局部的caspase3和8的活性会导致轴突生长障碍。这种效应似乎依赖于caspase介导的spectrin的裂解，spectrin是轴突弯曲和伸展所必需的与质膜相关的细胞骨架蛋白。Dronc已被证明以非凋亡方式切割发育中唾液腺的F－肌动蛋白丝，随后修剪一类感觉神经元中的树突。在发育中的小鸡胚胎中过量表达显性阴性突变体caspase 3，特别是在中脑突触前神经元中，导致树突的复杂性明显降低，这可以通过减少神经元的分支点和高阶分支看出。研究表明，在不同的模型物种中，caspase在神经节段重塑中的功能是保守的，依赖细胞骨架的调节，不同的caspase之间对细胞骨架底物的偏好不一样，caspase3已被证明可以同时裂解β－肌动蛋白和α－微管蛋白，而caspase 6仅靶向微管蛋白。
这种底物特异性是如何在非凋亡背景下建立和调节的，一种可能性是X－连锁抑制凋亡蛋白（XIAPs），如E3泛素连接酶，在整个神经元中的参与和可变性（图1和图2）。在系统水平，需要非凋亡caspase调节神经元中的细胞骨架，区分凋亡和亚致死caspase对细胞骨架的影响，高分辨率蛋白质是一个重要却被忽视的途径。超分辨显微镜微管和肌动蛋白束的单分子荧光标记技术，可以为这些不同的caspase介导的结果提供见解。
Caspases不仅在神经元生长和树脂化的过程重要，caspases也慢慢变得多地与突触可塑性调节和正常的突触生理学联系起来（图2）。长期抑制症（LTD），由于树突内caspase 3/9激活水平降低，神经元突触的功能逐渐减弱并伴随有树突棘大小的减少。长时程增强的相反过程，即神经元突触随时间增强，似乎不受基因或药理学上抑制caspase 3/9激活的影响。此外，依赖于NMDA受体（NMDAR）功能的LTD过程似乎受到BAD和BAX蛋白表达减少，这两种蛋白与线）。最近，BAD-BAX-caspase 3信号级联被证明可通过自噬调节突触囊泡池，小鼠在联想恐惧学习过程中可以通过其紧密协调。BAX-caspase 3的激活在皮质脊髓投射的活动依赖性重组中起着突出的作用，为获得神经元运动任务技能所必需。Caspase 3还直接调节AMPA受体亚单位GluA1的水平，以响应体内的慢性刺激。在斑马雀鸣禽中，暴露于新声音后，听觉皮层突触后隔室中切割的caspase 3水平强烈增加。
总之，这些发现证明在正常的生理过程中caspase活动参与了学习和记忆。在不同的学习模式中，caspase在树突和树突棘中的激活和定位将有助于阐明caspase活性如何影响脊柱转换和离子通道表达，如何在经验依赖性可塑性中影响树突棘和离子通道的表达。Caspase的招募是否取决于不同的程度经验诱导的可塑性？重要的问题还在于，在这些情况下，内源性的caspase活动如何与已知的在生理和病理情况下改变神经元活动的外在环境因素相互作用。
本质上激活的caspase受到各种环境因素的影响，在神经元中，与程序化细胞死亡相比，非凋亡信号的参与需要的激活阈值较低。因此一种或多种环境因素会增加通路激活的可能性，谷氨酸诱导的神经毒性，也称为兴奋毒性，是一种典型的神经元损伤，尤其是在经典凋亡的背景下。由于超生理水平的神经递质谷氨酸的存在，导致配体门控离子通道受体如（NMDA、AMPA和红藻氨酸）受体的过度刺激，最终导致神经毒性钙离子涌入。这种毒性通常表现为线粒体功能紊乱，活性氧和氮的生成增加，线粒体膜电位下降，最终，线粒体孔开放，继而出现细胞凋亡，钙离子涌入会激活钙离子依赖蛋白酶和磷酸酶，如钙蛋白酶和钙神经蛋白酶，它们反过来也能诱导执行器caspase的活性，形成反馈环。该蛋白酶－10已被证明可以控制肌动蛋白丝的运动，为细胞骨架的兴奋性毒性失调提供了第二种非caspase依赖性途径。研究发现海马CA1神经元钙内流下游的钙调神经磷酸酶信号传导介导了锚蛋白G的损伤，锚蛋白G是一种细胞骨架蛋白，对细胞轴突起始段的组织至关重要。在本研究中，损伤是缺血性的，源于大脑内侧动脉闭塞，尽管导致主要的细胞骨架重组和受损的动作电位产生，但并未导致显著增加的细胞死亡。鉴于已知caspase和钙依赖性蛋白酶/磷酸酶之间的相互作用，以及它们各自改变细胞骨架动力学的能力，分析它们对不同神经元群体亚致死性兴奋毒性结果的相对贡献将是重要的。
神经元细胞不会单独地发生神经毒性反应，造成损伤的环境因素也作用于胶质细胞和血管内皮细胞，这些非神经元细胞经历相同的特异性损伤效应，然后反馈到邻近的神经元细胞。在生理条件下，基于物理接触，包括隧道纳米管的细胞骨架突起、细胞外囊泡以及旁分泌信号可使神经元和胶质细胞进行串扰。在小胶质细胞中，暴露于炎症因子，如脂多糖，会触发启动器caspase 8以及caspase 3和7的激活，这反过来又通过蛋白激酶C（PKC）-δ信号驱动小胶质细胞进入促炎症表型。在神经元和星形细胞的培养中，接触（NMDAR拮抗剂），与单独处理神经元相比，会增强致命性神经毒性。从处理的星形胶质细胞中分离出的细胞外囊泡，特别是其中包含的靶向BDNF的长非编码RNA，似乎是造成这种影响的部分原因。非神经元细胞对caspase依赖性神经元凋亡的调节作用在亚致死性caspase活性环境中可能发挥更为重要的作用，具有相对较低的caspase激活阈值。
麻醉剂和乙醇是研究得最好的与发育性神经毒性有关的环境因素，最早的研究表明，在小鼠和大鼠模型中，急性和慢性乙醇暴露与caspase-3激活、神经元细胞死亡和神经变性相关，反应程度依赖于BAX蛋白活性。最近的研究发现，缺乏初级纤毛的小鼠前脑兴奋神经元在急性乙醇处理后表现出亚致死性caspase 3的激活，caspase激活的原因可能是由于纤毛丢失引起的PI3K/AKT信号减弱介导，单剂量对caspase 3激活会产生同样的影响。然而，在之前的研究中，同样的乙醇剂量会引起明显的神经退行性病变及神经元细胞丢失，导致这种差异的原因可能是caspase 3反应会随着时间减弱。与之前的相关证据相同，亚致死性caspase 3激活以点状呈现，并且与肌动蛋白和微管蛋白变性相关，随后在纤毛病小鼠中出现锥体神经元树突状复合体丢失。PI3K/AKT通过初级纤毛发出的信号可能是caspase激活的重要修饰物，也是细胞是否发生凋亡或亚致死性神经毒性变化的决定因素。
七氟醚和异氟醚等麻醉剂是复杂儿科手术不可或缺的组成部分，例如，先天性心脏病（CHD）患者的心脏矫正手术。在各种暴露动物模型中，挥发性和静脉麻醉剂都与典型的caspase诱导细胞死亡相关。最初在大鼠模型中发现，、一氧化二氮和异氟醚的联合暴露与广泛的caspase激活、神经退行性改变和随后的学习障碍有关。用于儿科大手术的许多麻醉剂作为NMDAR阻滞剂或GABA受体激动剂发挥作用，提示神经毒性的会聚模式。已经证明，异氟醚和七氟烷均通过破坏钙稳态和激活固有的线粒体凋亡级联来介导caspase依赖性神经毒性作用。在啮齿动物麻醉模型中，围产期暴露于七氟烷和异氟醚会导致长期行为损伤，包括记忆障碍、焦虑、抑郁、社交能力下降，运动协调能力受损。在婴儿恒河猴中，重复剂量（而非单次剂量）异氟醚与运动反射缺陷和社交焦虑增加相关，剂量依赖性效应表明，麻醉神经毒性的累积模型，更高的暴露频率导致更严重的神经细胞凋亡和神经变性变化。因此，遗传易感性或第二个环境因素的参与可能会降低caspase激活的阈值，并改变反应性质，将其从细胞死亡转移到细胞的结构和生理重塑。是儿科心脏手术的常见麻醉前用药，近期报道表明，多次处理可在大鼠模型中引起前额皮质和海马体caspase 3相关的神经退行性改变，以及空间记忆障碍、焦虑，减少创新行为等神经行为改变。
麻醉暴露相关的神经毒性也被认为是与年龄相关的认知能力下降和神经退行性变。阿尔茨海默病被认为主要是由于β－淀粉样蛋白（Aβ）在衰老大脑中的异常积累或清除减少。暴露于异氟醚的新生小鼠和人类神经胶质瘤细胞表现出caspase信号上游的Aβ42肽的寡聚增加，伴随着过度的caspase 3激活，最终导致突触损伤，异丙酚通过抑制Aβ42寡聚作用减弱了caspase的激活模式。Caspase激活的矛盾影响表明，当组合使用时，不同麻醉剂之间可能存在复杂的相互作用，因此，它们组合使用产生的半胱氨酸天冬氨酸酶激活信号可能属于亚致死范围，在亚致死范围内可以避免凋亡和自噬细胞死亡，而细胞骨架和突触损伤持续存在。
大多数关于麻醉神经毒性的研究与典型的细胞死亡有关，也涉及亚致死机制。来自人类胚胎干细胞的神经前体细胞（NPC）的体外证据表明，短期（2小时）暴露于临床七氟醚浓度不会诱导细胞死亡，更高的超临床浓度会暂时抑制分化。早期研究发现培养的海马神经前体细胞暴露于临床浓度和异丙酚不会诱导细胞死亡，但会促进神经元分化。对离体大鼠皮层NPC的治疗显示出相同的趋势，对凋亡和增强的神经元分化没有影响。这些研究共同表明，未成熟神经元前体更能抵抗麻醉诱导产生的细胞死亡，并且在新生儿阶段，大脑神经源性区域的非凋亡机制可能发挥重要作用。在另一项研究中，通过TUNEL染色评估异氟醚处理的海马NPC，显示切割的caspase 3水平显著增加，没有伴随细胞死亡。本研究中观察到的增强神经元分化的至少一部分机制解释是caspase3激活增加，因为用caspase 3抑制剂Z-DEVD-fmk治疗可挽caspase激活和神经元分化水平。如果caspase在海马等神经源性区域激活，新生儿期应该是一个特别脆弱的时间窗口。
麻醉对树突和突触超微结构的不利影响也已被证实，在七氟醚的情况下，离体大鼠皮层神经元急性暴露于七氟醚或地氟醚1小时不会导致明显的细胞死亡；然而，两种麻醉剂都导致神经突起长度缩短，并抑制自发突触电流。两种麻醉剂的损伤作用都是通过增加线粒体分裂来介导的，使用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1处理后可以改善线粒体形态以及突触和电生理缺陷。线粒体分裂是内在凋亡通路激活的关键步骤，是caspase 3裂解和激活的上游（图1）。鉴于在七氟烷和地氟醚之间观察到的与细胞死亡相关的线粒体碎片的差异水平，可以推测线粒体“渗漏”的“中间”水平导致相应的亚致死性半胱氨酸蛋白酶激活，其作用是抑制神经纤维生成和突触成熟，同时避免触发细胞死亡（如图2所示）。这项研究结果指出，未观察到麻醉暴露的案例中明显的神经变性和细胞死亡，这些更微妙的表型可能会在着重检测典型的caspase信号通路研究中被忽略。上述研究提示，这些研究是在细胞层面进行，但这些亚致死状态是否可以在体内复制尚未可知。
最近，一项大规模随机对照试验发现，暴露于1小时全身麻醉的组与接受清醒区域麻醉的对照组之间，随访5年的2岁儿童的神经发没有明显差异。虽然试验设计反映了儿科手术期间常用的方案，但它无法评估重复暴露的影响，也无法解释潜在的基因－环境相互作用和组合机制。患有CHD的儿童经常携带与调节细胞凋亡和细胞生存有关的遗传位点的多态性，其中包括Akt1和Gdf1基因，这两个基因都已知在调节caspase信号和细胞生存方面有相关作用。以上说明，一些遗传上的易感人群，如某些CHD患者，可能由于接触麻醉后增加caspase激活和caspase介导的神经变性增加麻醉诱发神经中毒的风险。
尚不清楚非致命但具有破坏性的caspase反应与这些病例有何联系，这值得进一步研究。了解从促进细胞死亡的caspase活动到亚致死结果的转换，可以使遭受caspase诱发的神经毒性的病人得到识别与更精准的治疗。
Caspase依赖的神经毒性是一个复杂的多步骤过程，涉及自主和非细胞自主功能，并受时间、剂量和其他潜在协变量的影响。如果caspase介导的亚致死性神经退行性是caspase依赖性细胞死亡的一个主要机制，那么慢慢的变多的caspase抑制剂将为神经保护提供一个可能的治疗方法。其中，Z-VAD-FMK和Boc-D-FMK显示出强大的抗caspase特性，但它们均已被证明会诱发不良反应。另一个可行的替代方案是泛天冬酶抑制剂Q-VD-OPh，它具有更高的疗效、能够最终靠血脑屏障扩散、毒性更小的特点。Q-VD-OPh已证明可以防止围产期缺血、脊髓损伤和阿尔茨海默氏症等模型中的细胞凋亡。
除了广谱caspase抑制剂外，治疗策略可能旨在间接抑制caspase激活和随后的神经元损伤。线粒体裂变和分裂是已知的内源性caspase 3激活剂，已有研究证明喹唑啉酮Mdivi-1抑制剂保护神经元干细胞免受氧化损伤和凋亡，长期以来，PI3K/AKT通路在各种损伤模式下发挥显著的神经保护作用，部分通过限制caspase激活。PI3K/AKT小分子激活剂SC79的使用可能对凋亡和亚致死损伤都有好处，因为它已被证明可以保护神经元免受氧化应激。
由于caspase在正常神经发育和成熟过程中发挥着各种非凋亡作用，在关键的发育时间点使用广谱caspase抑制剂可能会有一定的风险。由于大多是较低的caspase激活阈值产生亚致死效应，因此在使用caspase抑制剂抑制细胞死亡的案例中，评估残余的caspase活性和细胞骨架的完整性非常重要。在可能需要持续的抑制剂治疗的情况下，如阿尔茨海默氏症、帕金森氏症和亨廷顿氏症等进行性神经退行性疾病中，值得关注的是对生理性caspase功能的干扰。未来对发育性麻醉神经毒性的研究需要更仔细地解决细胞形态、功能性神经回路的建立和行为方面潜在的亚致死性、caspase依赖的不良后果。在临床前模型中评估caspase激活阈值，同时彻底滴定靶向caspase激活、细胞内信号（如PI3K/AKT）和线粒体稳定性的治疗方法，对于完全表征和靶向亚致死反应是必要的。
过去几十年来，在神经系统中程序性细胞死亡背后的分子机制及其对细胞形态、生理学和生物体行为的影响方面的研究取得了重大进展。对caspase及其底物的激活产生影响的进一步研究为设计新的具有疗效的caspase抑制剂提供了理论依据。此研究主要目的是了解典型的细胞凋亡信号，希望可以在神经退行性损伤的情况下进行抑制，或在致癌过程中进行激活。同时，caspase非致死信号传导途径也越来越受到关注，阐明该信号通路在神经元树突延伸和分枝、经验的可塑性和学习中的及其重要的作用以及它在损伤场景中如何被利用方面已经取得了进展。超分辨率成像、体外神经细胞培养、CRISPR-Cas9基因组编辑和测序方法的进步，以及已确定的损伤模型定位研究，以剖析亚致死性caspase激活优先于caspase驱动的凋亡的条件。这些前瞻性研究对于破译临床相关药物（如麻醉剂）神经毒性背后的细节尤为重要，这些药物对于外科手术（如儿童CHD患者）仍然不可或缺。
在正常大脑发育和神经退行性变中，半胱天冬酶（caspase）途径启动的细胞凋亡发挥着重要作用，而最近，caspase激活慢慢的变多地与生理和病理非凋亡结果相关，激活caspase途径可以触发细胞内非凋亡事件并产生多种作用，包括免疫功能、细胞增殖和分化、细胞命运规范和细胞骨架功能。且该信号通路在神经元树突延伸和分枝、经验的可塑性和学习中的及其重要的作用以及它在损伤场景中如何被利用方面已经取得了进展，在这篇综述中，重点介绍了神经元发育和成熟过程中非凋亡caspase的关键功能，以及它们在发育性脑损伤触发病理过程的作用。并且总结了最新发现的非凋亡caspase途径如何长期导致神经功能损伤，并讨论了其潜在的治疗途径。
